Cuando los experimentos no salen como uno espera

Por Lluis Montoliu, el 3 junio, 2023. Categoría(s): genética • genoma • sistema científico • tribuna de opinión ✎ 9
Gráfico que representa un coronavirus. Imagen: banco de imágenes libres de Office (Microsoft)

La pandemia de COVID-19, causada por la infección de un coronavirus, SARS-CoV-2, y que surgió a principios del año 2020 nos afectó a todos de múltiples formas. El enorme impacto que nos produjo el confinamiento, con las hoy más de 689 millones de personas infectadas y los 6,8 millones de personas fallecidas hizo que, en el colectivo de personas que nos dedicamos a la investigación, muchos nos preguntáramos qué podíamos hacer para contribuir a resolver este fenomenal problema sanitario a nivel planetario que progresaba sin control, mientras se estaban desarrollando las primeras vacunas contra la COVID-19, que, recordemos, no estuvieron listas hasta finales de ese año.

En enero de 2020 había muy pocos especialistas en coronavirus. En España, el laboratorio de referencia era el dirigido por Luis Enjuanes e Isabel Sola, en el Centro Nacional de Biotecnología, que llevaba más de 30 años investigando estos virus. Ellos eran los verdaderos expertos. Pero surgieron por doquier muchas propuestas de investigación para desarrollar nuevas vacunas e iniciativas innovadoras para investigar, detectar, diagnosticar o combatir este coronavirus, incluidas diversas iniciativas gestadas también en nuestro centro, el Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC).

¿Qué podíamos hacer nosotros? Mi laboratorio está especializado en genética, en enfermedades raras, en el desarrollo de modelos animales por edición genética con las herramientas CRISPR-Cas, algo en lo que fuimos pioneros en nuestro país. Y, hablando con Miguel Ángel Moreno Mateos, excelente biólogo del desarrollo del CABD en Sevilla, y experto en los nuevos sistemas CRISPR, se nos ocurrió una idea que parecía estupenda, imbatible, destinada a funcionar, sí o sí. Aunque la mayoría de las herramientas CRISPR-Cas que conocemos cortan ADN guiadas por una pequeña molécula de ARN, también existen otros sistemas CRISPR-Cas que cortan ARN, guiadas también por ARN. Feng Zhang fue quien primero las descubrió y describió, llamándolas Cas13 e imaginando su aplicación en estrategias de diagnóstico genético. Los sistemas CRISPR-Cas13 cortan moléculas de ARN guiadas por otra molécula de ARN, complementaria a la primera. Si el genoma del coronavirus SARS-CoV-2 es una molécula de ARN, y si los sistemas CRISPR-Cas13 pueden cortar moléculas de ARN… pues blanco y en botella: ¿por qué no usar estos nuevos sistemas CRISPR para cortar el genoma del coronavirus y así lograr inactivar este agente infeccioso?

Propuesta experimental de Nguyen et al. 2020 para usar CRISPR-Cas13d para combatir la infección por coronavirus SARS-CoV-2

La idea de usar los nuevos sistemas CRISPR-Cas13 para cortar el genoma del coronavirus parecía buena. Pero no fuimos los únicos a quienes se les ocurrió. Esto sucede mucho en ciencia. La asociación de ideas en base al conocimiento existente es frecuente en el mundo de la investigación. Somos muchos científicos y científicas manejando la misma información y es natural que lleguemos a conclusiones similares más o menos simultáneamente. Y este caso no fue una excepción. Investigadores de Harvard y de Stanford plantearon o llevaron a cabo experimentos similares. En estos dos casos se postulaba el uso de la nucleasa Cas13d, la más específica de las Cas13, sobre el papel, la que podíamos usar para cortar únicamente el ARN del coronavirus, dejando intactos el resto de ARN mensajeros de la célula. Y eso fue lo que nos planteamos: usar un sistema CRISPR-Cas13d para digerir el genoma del coronavirus causante de la pandemia. Este proyecto lo expliqué en muchos medios de comunicación, con total transparencia, como por ejemplo en este artículo de The Conversation. Esto es algo poco común, explicar públicamente un experimento antes de realizarlo. La pandemia permitió estas innovaciones en comunicación científica.

Nuestro laboratorio tenía experiencia en los sistemas CRISPR, gracias a los estudios pioneros de Davide Seruggia (que realizó la tesis con nosotros y ahora lidera su propio laboratorio en Viena, tras un exitoso periodo postdoctoral en Boston) y al gran trabajo realizado por Almudena Fernández, investigadora senior del CIBER en nuestro laboratorio. Pero ni somos virólogos ni tampoco conocíamos en detalle el funcionamiento de los nuevos sistemas CRISPR-Cas13. Había que colaborar con otros grupos que solventaran nuestros déficits de conocimiento. Se lo planteé a Dolores Rodríguez, estupenda viróloga del CNB, con gran experiencia en nidovirales, el orden de virus que incluye a los coronavirus y a los torovirus, que son su especialidad. Todos virus con un genoma de ARN. Por su parte, Miguel Ángel Moreno Mateos, era uno de los pocos especialistas internacionales en los sistemas CRISPR-Cas13d.

Los tres laboratorios nos pusimos manos a la obra, escribiendo un proyecto de investigación colaborativo que aportara novedades frente a lo que ya se había hecho. Optamos por las ribonucleoproteínas (RNP). Apostamos por administrar a las células infectadas con el coronavirus un complejo RNP formado por la proteína Cas13d y la molécula guía de ARN dirigida contra las zonas del genoma del coronavirus que estuvieran más conservadas, para asegurar que esta aproximación siguiera siendo válida para todos los diferentes coronavirus que iban sucediéndose, a medida que este virus iba evolucionando durante la pandemia. Aprovechando datos de estudios previos publicados por el grupo de Stanford decidimos diseñar guías contra la región de los genes RdRP y N del genoma del coronavirus, que codifican la polimerasa y la nucleoproteína del coronavirus, respectivamente.

Los cuatro investigadores que colideramos el proyecto científico de usar CRISPR-Cas13d para destruir el genoma del coronavirus

Durante la primavera confinada de 2020 enviamos nuestra propuesta científica colaborativa a diversas agencias, fundaciones, instituciones y administraciones con la esperanza de que alguien nos financiara este proyecto de investigación. Nadie nos financió. No lo entendíamos. Nos parecía un proyecto novedoso e innovador. Llamamos a muchas puertas, a muchas instituciones y fundaciones, sin éxito, hasta que remitimos nuestra propuesta a la Plataforma de Salud Global del CSIC, que finalmente seleccionó y financió nuestra idea con una modesta cantidad de dinero. Poco antes del verano de 2020 pudimos ponernos manos a la obra y desarrollar nuestro proyecto de investigación colaborativa, que se unió a los muchos que ya se estaban desarrollando en el CNB.

El proyecto tenía varias fases y estaba pensado para aprovechar las fortalezas de todos los laboratorios implicados. El laboratorio de Miguel Ángel Moreno Mateos en el CABD, experto en el manejo de peces cebra, se encargó de seleccionar las mejores guías ARN contra los genes RdRP y N usando embriones de estos vertebrados, en los que coinyectaba la proteína Cas13d, la guía ARN experimental y el ARN diana de los genes RdRP y N. Utilizamos los embriones de pez cebra para encontrar y validar las mejores guías ARN que sustentaran la digestión de los ARN de los genes RdRP y N y las que mostraran una menor toxicidad.

Trabajar con un agente infeccioso potencialmente peligroso, como el coronavirus SARS-CoV-2, que es mortal para un porcentaje considerable de las personas infectadas, exige unas medidas de bioseguridad especiales. En particular el trabajo con este coronavirus requiere un nivel 3 de bioseguridad (BSL3). El CNB cuenta con un laboratorio BSL3 para realizar estos experimentos, muy solicitado durante toda la pandemia, lógicamente. Pero es engorroso y caro trabajar en estos laboratorios BSL3, con un control estricto de acceso y salida y una gestión muy controlada de todos los residuos que se generan en su interior. Por eso aprovechamos la experiencia del laboratorio de Dolores Rodríguez en el CNB en otros nidovirales, como los torovirus equinos BEV, o la experiencia de Fernando Almazán (que colidera el laboratorio con Dolores Rodríguez, a su vez experto en trabajar en laboratorios BSL3) en otros coronavirus menos peligrosos, que causan el resfriado común, para testar nuestra propuesta experimental en estos otros virus, que también tienen un genoma de ARN, pero que pueden ser investigados en un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad (BSL2), con mayor facilidad. En nuestro laboratorio nos encargaríamos de coordinar la administración de estos complejos CRISPR-Cas13d a las células en cultivo y de analizar los resultados.

Parecía un proyecto de los de sota, caballo y rey. Destinado a triunfar. ¿Qué podía salir mal?

Pues un montón de cosas. No hay proyectos sencillos. La biología siempre es más complicada de lo que uno imagina. Y cuando uno cree ingenuamente dominar todos los parámetros de un proyecto siempre surgen aspectos inesperados que obligan a variar las estrategias iniciales y a explorar otros caminos, inicialmente no previstos. Así es la ciencia. Lo llamamos método científico.

Nos encontramos con problemas que no por sabidos no dejaron de sorprendernos y nos obligaron a investigar alternativas. El problema principal al que nos enfrentamos fue decidir qué método o estrategia usaríamos para introducir los complejos de RNP (Cas13d + guía ARN) dentro de las células infectadas con los virus, un proceso que habitualmente conocemos como transfección. Y este era un proceso que debía suceder de forma robusta, reproducible y significativa, siendo capaces de transfectar un gran número de células, para que los resultados fueran exitosos.

Pero no. Ahí nos encallamos.

Las guías ARN estaban estupendamente validadas en Sevilla por el laboratorio de Miguel Ángel Moreno Mateos. Los torovirus BEV infectaban primorosamente las células equinas en las expertas manos de Dolores Rodríguez y su equipo. Pero no lográbamos transfectar las RNPs de forma substancial a estas u otras células usando diversos reactivos de transfección comerciales. La entrada de las RNPs solamente se apreciaba en menos del 1% de las células transfectadas. Lo intentamos transfectando solo ARNs (tanto el ARN guía como el ARN que codificaba la proteína Cas13d) con idénticos o peores resultados. Cuando electroporamos (un sistema de transfección que usa un chispazo eléctrico para abrir pequeños poros en la célula por los que entran los elementos a transfectar, proteínas y ARNs) células susceptibles de ser infectadas por el coronavirus SARS-CoV-2 en el laboratorio BSL3 observamos que alrededor del 20% de las células tenían la Cas13d en su interior. Al infectarlas luego con el virus observamos que descendía el título de coronavirus (el número de partículas virales) menos de dos veces, un valor muy modesto, anecdótico y alejado de nuestros objetivos, que perseguían reducir ese número en varios órdenes de magnitud (cien o mil veces menos, por lo menos), para que el experimento pudiera tener alguna trascendencia terapéutica. No observamos nada parecido. No éramos capaces de introducir los sistemas CRISPR en las células en una proporción suficiente para que pudieran digerir los genomas de los coronavirus de forma significativa.

Validación de seis guías ARN contra el gen de la nucleocápside y de la ARN polimerasa testadas por el laboratorio de Miguel Ángel Moreno Mateos en el CABD en Sevilla, usando el sistema de embriones de peces cebra. Las mejores guías (encuadradas en los rectángulos rojos) son las que provocan un descenso más acusado de los niveles del ARN de los genes diana en relación al ARN control intacto.

Lo que siguió fue un carrusel de pruebas de todo tipo para explorar sistemas de transfección alternativos, a partir de nuevas colaboraciones establecidas con científicos de diferentes instituciones del país, a cual más original, innovadora y prometedora. Todas estas múltiples pruebas resultaron infructuosas. Nada funcionó. En alguna ocasión conseguimos una reducción algo importante en el número de virus, pero no fuimos capaces de reproducir este mismo resultado cuando repetimos el experimento.

Finalmente, en diciembre de 2022, dos años y medio después de haberlo iniciado, y tras varias prórrogas solicitadas al CSIC para seguir ejecutando el proyecto, decidimos poner punto final al mismo, sin haber obtenido los resultados esperados.

Efectivamente, no siempre los experimentos salen como uno espera. De hecho, la mayor parte de experimentos que hacemos en los laboratorios no suelen funcionar tal y como esperábamos. Equivocarse o enfrentarse a resultados negativos es más habitual de lo que pueda parecer desde fuera del universo científico. Esta es la parte con menos glamour de la ciencia. Nos encanta contar los éxitos, cuando los experimentos producen resultados espectaculares. Las revistas científicas y noticias de ciencia van llenas de este tipo de reportajes. Pero por cada experimento que produce estos resultados tan positivos hay muchos más que no funcionan como se esperaba, muchos más que producen resultados negativos, muchos más que difícilmente verán la luz y se archivan en un cajón. Como este proyecto que estoy aquí relatando, en nombre de todos mis compañeros. Es una ilusión pensar que todos los experimentos científicos siempre saldrán como se planifican y producirán los resultados esperados. Esto no sucede. Y para muestra un botón, este proyecto que parecía que sería un camino de rosas se convirtió en un muro infranqueable que no logramos superar. Ni nosotros ni, por cierto, ningún otro laboratorio en el mundo, lo cual no sé si nos consuela, pero quizá explique la gran dificultad a la que nos enfrentábamos.

La entrega (delivery en inglés) de estos complejos proteicos con ARN, las RNP con Cas13, a las células, la entrada de estos compuestos, sigue siendo el talón de Aquiles. Es el principal caballo de batalla, tal y como recoge una revisión muy reciente de este tema. Ha habido algunos (pocos) experimentos que han demostrado el uso de vectores virales (como los virus adenoasociados, AAV) o nanopartículas para introducir los sistemas CRISPR-Cas13 en el interior de las células infectadas con el coronavirus. Estos experimentos han mostrado un cierto éxito en modelos animales o en células humanas en cultivo, pero ninguno de estos proyectos ha sido evaluado todavía en personas. Estos estudios usan no solo Cas13d, sino Cas13a y Cas13b. Y algunos estudios alertan sobre la falta de especificidad de estas estrategias, que más allá de degradar los ARN de los virus también pueden acabar degradando ARNs propios de la célula, algo que obviamente no debería de ocurrir.

Estamos todavía lejos del uso de la tecnología CRISPR como tratamiento antiviral.

Nota final: El texto de este artículo, escrito por Lluís Montoliu, ha sido revisado por Almudena Fernández, Fernando Almazán, Dolores Rodríguez y Miguel Ángel Moreno Mateos. Todos nosotros agradecemos a los laboratorios de Pablo del Pino, Manuel Collado y Begoña Sot sus esfuerzos realizados y la colaboración prestada para intentar completar este proyecto con éxito. Se agradece especialmente el enorme trabajo realizado por Ismael Moreno en el laboratorio de Miguel Ángel Moreno Mateos, seleccionando y validando en embriones de peces cebra las mejores guías ARN para cada uno de los virus y los genes seleccionados.

Una versión editada y reducida de este artículo ha sido publicada en The Conversation el 25 de junio de 2023



9 Comentarios

  1. Muy interesante y en efecto muestra una realidad de las investigaciones en ciencias exactas, particularmente en Biología. También muy importante ya que nuestros estudiantes al realizar sus trabajos de investigación se enfrentan a esa realidad y les toca replantear sus temas. Muchas gracias

  2. Magnífico y pedagógico artículo, que más allá de las conclusiones (muy importantes) sobre las dificultades de la «edición» genética a través de CRISPR, muestra la realidad de la ciencia. Buena parte de ella, aunque tan valiosa como la que obtiene resultados positivos, no los alcanza. Pero esta parte valiosa de la ciencia se desconoce porque no es publicable en los medios actuales de difusión científica, que consideran que los resultados negativos tienen menor impacto, lo cual es muy discutible. Y, sin embargo, publicar es una exigencia de los comités de evaluación para seleccionar personal, financiar proyectos científicos, otorgar premios y reconocimientos, etc. Es algo que debemos intentar cambiar. Un artículo muy recomendable para investigadores/as en formación.

  3. Hola Luis, totalmente de acuerdo en lo que explicas en este artículo. Las cosas pueden salir mal en ciencia y lo que me deja más perplejo es la falta de empatía científica a nivel de las instituciones financiadoras que hace que ideas muy buenas no sean subvencionadas y que los investigadores hayan de buscar recursos debajo de las piedras. Recuerdo como tú cuentas en el principio de la pandemia como todos los investigadores queríamos hacer algo para ayudar aunque nuestros campos estuvieran alejados aparentemente porque con imaginación se puede llegar a una aproximación experimental. Como investigadores en Bioquímica y Biología Molecular en la Facultad de Farmacia de la UB diseñamos una estrategia basada en la utilización de pinzas de polipurinas (PPRHs) para la formación de tríplices con el RNA del virus del SARS-CoV-2 para frenar su proliferación. Empezamos a realizar experiencias pero en tres convocatorias especiales para la pandemia no nos dieron ni un euro. Era increíble. Finalmente en una Marató de TV3, 18 meses después de la pandemia tuvimos una ayuda económica. En nuestro caso conseguimos una metodología con la utilización de los PPRHs para diseñar un dispositivo de detección del virus rápido y sin termocicladores de PCR ideal para utilizarlo como POC (point of care). Adicionalmente, hemos demostrado que las mismas moléculas tienen actividad antiproliferativa del virus. Nos hemos cruzado en algunos meetings científicos y te comento todo esto para abonar tu articulo donde queda claro que los científicos arrimamos el hombro para lo que sea y que deberíamos tener un apoyo institucional a nivel de pacto para la ciencia donde se pudiera dar respuesta acelerada a cualquier problema que se pueda plantear, incluyendo la previsión.

  4. Es evidente que si la entrega pudiese realizarse de forma eficiente, ésto no sólo sería aplicable contra los virus, también contra el cancer, las enfermedades raras e incluso el biohackeo.

  5. Insistes entre líneas en lo que no sabemos que no sabemos. Cuando en principio están controlados todos los parámetros y no parece que vaya a haber dificultades insalvables, pues resulta que la realidad te pone en tu sitio. «Algo» que obviamente no se sabe, te impide llevar a cabo un proyecto impecable como el que diseñásteis y escribísteis.
    Cuentas la intrahistoria de manera que hipnotizas y no se puede dejar de leer una vez que se empieza.
    Un auténtico placer leerte.
    Hearty thanks

  6. Felicidades por su valiosa investigacion y amor a la ciencia. Y sobre todo por su honestidad y ética profesional. En efecto, los experimentos no son como lo imaginamos pero lo importante es no bajar la guardia y seguir siempre con ese espíritu de lucha, innovación y dedicación a la investigación, gracias a nuestro trabajo el mundo tendrá una esperanza de progreso. De mi parte será un placer conocerlos.

    Saludos

    Dr. Jorge Omar Gómez García
    Departamento de Quimica Orgánica
    Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
    Instituto Politécnico nacional
    Laboratorio de investigación en Química Farmacéutica

  7. Tengo una duda.Me gustaría saber cómo es tan difícil que entren estos complejos proteicos que al fin y al cabo son compuestos formados por ARN y se ha podido fabricar vacunas de ARNm que entran ,parece ser ,con facilidad dentro de la célula.
    Por cierto, aunque no haya triunfado, el diseño del experimento esta muy bien. Felicidades por vuestro trabajo.
    Y por todo lo que nos aportáis.
    Gracias por todo

  8. Hola Luis. Tengo una duda, si el problema es que el Complejo de RNP no entra en la célula, cómo con las vacunas de ARNm no ha habido problemas en que entren , o es que se utiliza otro sistema de transfección.
    De todas formas, me parece muy interesante aunque no haya salido como se esperaba.
    Muchas gracias por tus aportaciones en la divulgación de la ciencia.

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