Llega CARMEN para llevar SHERLOCK a la enésima potencia

Por Lluis Montoliu, el 30 abril, 2020. Categoría(s): diagnóstico genético • genética ✎ 12
Imagen del nuevo chip CARMEN creado por investigadores del Instituto BROAD. Fotografía: Michael James Butts

La capacidad de asombro y sorpresa que generan las herramientas CRISPR sigue intacta. Unos investigadores del Instituto BROAD acaban de publicar en la revista Nature un nuevo método que combina el diagnóstico genético basado en la nucleasa Cas13 (SHERLOCK) con microfluídica (nanogotas) para permitir la detección simultánea de centenares de virus distintos en un número limitado de muestras clínicas, o la detección de un solo virus (por ejemplo el coronavirus SARS-CoV-2, causante de la COVID-19) en más de mil muestras clínicas. La nueva técnica, por supuesto, tiene un no menos ingenioso nombre: CARMEN, acrónimo de (Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids).

Los autores comentan en esta publicación que, hoy en día, conocemos el genoma de 576 virus distintos. De 169 de ellos tenemos al menos 10 genomas publicados. Pero solamente de 39 hay diagnósticos aprobados por la FDA. Estos investigadores han logrado combinar, gracias a CARMEN-Cas13, la detección simultánea de esos 169 virus en 58 pacientes. Teóricamente el chip que han diseñado de microfluídica (nanogotas) permite la realización de más de 4500 test simultáneos estadísticamente significativos, con sus réplicas y controles, con un coste más de 300 veces menor. Los números apabullantes de esta nueva técnica CRISPR merecen una lectura pausada del artículo.

Hay por lo menos dos grandes tecnologías detrás de CARMEN. Por un lado está SHERLOCK, técnica de diagnóstico basada en CRISPR y en la nucleasa Cas13, desarrollada por el equipo de Feng Zhang, que conocimos en 2017 y se amplió en 2018. Y por otro lado la microfluídica, la generación de nanogotas que pueden incorporar diferentes componentes y que, al mezclarse, pueden disparar la reacción de detección del virus correspondiente.

Tecnología microfluídica con nanogotas que desarrolló el laboratorio de Paul Blainey en 2018 para analizar simultáneamente miles de compuestos capaces de evitar la resistencia a antibióticos de bacterias. Fotografia: vídeo en YouTube del instituto BROAD.

Los investigadores han empleado la plataforma de microfluídica que usa nanogotas, desarrollada por el laboratorio de Paul Blainey en 2018 (e ilustrada en este vídeo) para generar dos tipos de nanogotas (cada nanogota tiene un volumen de un nanolitro, es decir, una mil millonésima parte de un litro). Por un lado nanogotas que portan la muestra clínica sobre la que se quiere detectar la presencia de virus, y por otro lado nanogotas que portan la nucleasa Cas13a, los crRNA (las pequeñas guías de ARN específicas para cada virus) y el resto de reactivos del sistema de detección. Las nanogotas de los dos tipos se mezclan y se depositan, en pares, en todas las combinaciones posibles, al azar, en un chip de silicona (PDMS) que tiene impresos decenas de miles de estos compartimientos en los que solamente caben dos de estas nanogotas (como en la ilustración adjunta). Las muestras están codificadas con múltiples combinaciones de colores fluorescentes (los autores han conseguido crear 1050 colores fluorescentes distintos combinando cuatro fluoróforos en diferentes cantidades). Las dos nanogotas de cada nanopocillo pueden fusionarse mediante un estímulo eléctrico y esto permite (cuando se han fusionado dos nanogotas, una de cada uno de los dos tipos) que se inicien miles de reacciones simultáneas que generan resultados fluorescentes con múltiples colores, que es lo que finalmente se lee e interpreta, usando un microscopio de fluorescencia.

Esquema explicativo del nuevo sistema CARMEN-Cas13 para la detección simultánea de múltiples virus en diversas muestras clínicas de pacientes. Los seis pasos de la técnica están ilustrados en este esquema incluido en la primera figura el artículo Ackerman, Myrhvold et al. Nature (2020) https://doi.org/10.1038/s41586-020-2279-8.

La sensibilidad del método es del orden de attomolar (una trillonésima de mol). Las combinaciones posibles son el producto del número de muestras de pacientes a diagnosticar (N) multiplicado por el número de guías crRNA específicas de cada virus (M) que usará la nucleasa Cas13 para cortar, es decir: N x M. Teniendo en cuenta la limitación en el número de colores fluorescentes que son capaces de detectar (1050) cada uno de estos chips es capaz de detectar un solo virus (por ejemplo el causante de la COVID-19) en más de mil muestras de pacientes (1050 x 1 = 1050), o un número mucho mayor de virus (los investigadores lo probaron con los 169 virus de los cuales se tienen por lo menos 10 genomas descritos de cada uno) en un número mucho más reducido de pacientes (5), (169 x 5 = 845), con los controles y réplicas correspondientes.

Las posibilidades y combinaciones que permite la técnica CARMEN son virtualmente infinitas. En la parte final de su estudio, los investigadores del instituto BROAD, aplican CARMEN-Cas13 para la detección de todos los serotipos del virus de la gripe A (IAV), que varian esencialmente en dos genes, el de la hemaglutinina (H) y el de la neuroaminidasa (N). Se conocen 16 subtipos de H (H1-H16) y 9 subtipos de N (N1-N9), lo cual genera 144 (16 x 9) combinaciones en las que puede presentarse el virus de la gripe. Usando guías específicas de cada uno de los subtipos H y N es posible diagnostica que serotipo de virus de la gripe es el que ha infectado a una persona (p.e. H3N7). Los autores finalizan este sorprendente trabajo probando CARMEN-Cas13 para detectar la presencia de diversas mutaciones en el genoma del virus HIV, causante del SIDA, que se sabe confieren resistencia a los medicamentos antivirales.

El trabajo es una colaboración entre los laboratorios de Paul Blainey y Pardis Sabeti, liderada por sus respectivos investigadores postdoctorales Cheri Ackerman y Cameron Myhrvold.

 



12 Comentarios

  1. Hola….solo para comentar desde mi supina ignorancia, estos «sorprendentes» resultados no llevarían a un premio Nobel en el futuro?…..y gracias por tu divulgación. Saludos desde México.

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