Un gran fiasco en la edición genética de animales

Terneras de dos meses de edad de la raza Holstein editadas genéticamente por la empresa Recombinetics, sin cuernos, tras haber incorporado la mutación POLLED de la raza Angus, que nunca desarrolla cuernos. En la foto de la izquierda el animal llamado «Spotigy». En la foto de la derecha los animales «Buri» (izquierda) y «Spotigy». Fotografías tomadas de la figura 1 de la publicación Carlson et al. 2016 en Nature Biotechnology.

La transparencia es fundamental en ciencia y tiene que servir para hablar, con todos los detalles posibles, de los éxitos que se logren. Pero también debe servir para hablar de los fracasos, errores o fiascos, como el que hemos conocido en las últimas semanas, vinculado a las famosas vacas sin cuernos creadas usando la revolucionaria tecnología de edición genética por Recombinetics, una empresa norteamericana de Minnesota, e incluidas en una publicación científica en 2016. Escojo este gran fiasco en edición genética, inesperado, que sorprendentemente no parece haber sido detectado por demasiados medios de comunicación, pero sí recogido por el MIT Technology Review y otros, para abrir este nuevo blog sobre Gen-Ética en el espacio Naukas, en el que pretendo ir comentando temas de genética y de ética, dos disciplinas con las que trabajo y que me apasionan. La ciencia avanza a través de éxitos y fracasos, aciertos y errores. Nuestra credibilidad como investigadores depende por igual de cómo compartimos nuestros logros, y también nuestras meteduras de pata. En definitiva, la ciencia la hacen las personas, y estas, naturalmente, pueden equivocarse. No hay nada más humano que errar. Cuando esto ocurre hay que afrontar el error, explicarlo y aprender del mismo, para intentar evitar cometer errores similares en el futuro. No hay otro camino.

Las terneras Buri y Spotigy, llamadas así por sus creadores en la empresa Recombinetics, nacieron en 2015 y fueron las primeras vacas de la raza Holstein (las típicas vacas lecheras blancas y negras) que no desarrollaron cuernos, evitando así tener que ser descornadas (serrando los cuernos) o desmochadas (cauterizando el esbozo de cuerno cuando empieza a crecer), procedimientos muy agresivos y nada agradables para los animales. Ni para los granjeros. Más de 13 millones de vacas son descornadas anualmente en EEUU, según indicaron los autores en el estudio en el que presentaron estas primeras terneras editadas en sociedad. Recombinetics encontró esta solución innovadora y elegante, usando la tecnología de edición genética. Decidieron incorporar en el genoma de las vacas de la raza Holstein (con cuernos, HORNED) una variante genética del genoma de las vacas de la raza Angus (vacas de color negro, apreciadas por su carne), portadoras de la mutación dominante POLLED, que provoca que nunca desarrollen cuernos, mediante la tecnología de recortar y pegar a nivel molecular.

Introducción de la mutación dominante POLLED (Pc) en el locus HORNED conseguida a través de edición genética mediada por las herramientas TALEN. Figura adaptada de Tan et al. PNAS 2013.

La mutación POLLED (en realidad la variante Celta de la mutación POLLED, de ahí que se la denomine también Pc) en realidad es una duplicación de 212 nucleótidos (las bases A, G, T y C, que forman los genomas de la vaca, y también el nuestro) que substituye a 10 nucleótidos originales en el locus intacto (variante HORNED). En la figura adjunta, derivada de la publicación de Tan y colaboradores en la revista PNAS en 2013, los investigadores de Recombinetics usaron las herramientas TALEN, anteriores a las CRISPR, para duplicar una secuencia (flecha roja) eliminando 10 letras en el proceso. De ahí que la secuencia de ADN original de HORNED (una flecha roja) se convierta en POLLED (dos flechas rojas), y el fragmento de ADN analítico pase de 365 a 567 letras de longitud (365-10 = 355 + 212 = 567). Las herramientas TALEN utilizadas, en esencia, realizan la misma función que las CRISPR: cortan el ADN de forma precisa en el lugar indicado del genoma. Aunque lo hace de forma distinta a las CRISPR. En el caso de las TALEN (acrónimo en inglés de Transcription Activator-Like Effector Nuclease) quien dirige la nucleasa a cortar una secuencia de ADN no es una pequeña molécula de ARN, como las CRISPR, sino una proteína TALE, derivada de una bacteria que infecta a las plantas y toma el control de sus células, unida a una nucleasa (N), que es quien acaba cortando el ADN. Las proteínas TALE pueden construirse en el laboratorio y, siguiendo un código deducido tras analizar muchas de ellas en la naturaleza, se pueden «programar» para que encuentren una secuencia de ADN determinada.

Recombinetics revolucionó las aplicaciones de la edición genética con este experimento, realizado sobre células (fibroblastos) obtenidas de toros de la raza Holstein. Limpiamente habían conseguido convertir el locus HORNED en POLLED. Los fibroblastos editados genéticamente resultantes los usaron para derivar toros Holstein que, ahora sí, nunca más desarrollarían cuernos. Para ello utilizaron la técnica de SCNT (transferencia nuclear de células somáticas), también conocida como clonación (que descubrimos con el nacimiento de la oveja Dolly) para reconstruir embriones de toro con núcleos de estas células Hosltein editadas. Y nacieron dos terneritas: Buri y Spotigy, que se describieron en 2016. Dos magníficos animales de la raza lechera Holstein… pero sin cuernos. Naturalmente los investigadores usaron fibroblastos de toro para poder obtener animales macho, de los cuales derivar esperma para rápidamente fecundar muchas vacas y transmitir la nueva variante de forma eficaz en la población bovina. Si los investigadores hubieran querido movilizar la mutación POLLED desde Angus a Holstein mediante cruces tradicionales habrían tardado muchos años y muchas generaciones, hasta conseguir una vaca que siguiera reteniendo la producción lechera de las Holstein pero sin cuernos, eliminando todo el resto del genoma de Angus que no necesitaban. Durante la meiosis, necesaria para producir los gametos en cada generación, se habrían mezclado los genomas de Holstein y Angus, produciendo vacas de características intermedias que no serían de interés. Este es el eterno problema de la mejora genética tradicional, que ya sabemos que no es una solución práctica. La edición genética permitía solucionar, de forma limpia, el problema. Y en una sola generación. O al menos eso pensaban. Eso pensamos todos. Yo mismo dediqué a estas asombrosas vacas sin cuernos uno de los capítulos de mi libro «Editando genes: recorta, pega y colorea» (NextDoor Publishers, 2018), y las he usado profusamente como ejemplo en muchas de las charlas que he impartido sobre edición genética.

Ternera Holstein editada (sin cuernos). Fotografía de Alison Van Eeneeman (UC Davis) en MIT Technology Review.

Recombinetics presentó las vacas Holstein editadas, sin cuernos, en multitud de reuniones científicas, cosechando admiración y aplausos. Y se enfrentó a la poderosa FDA, la agencia norteamericana encargada de la seguridad en alimentos y medicinas, que proponía considerar el ADN editado como un «nuevo medicamento» y, por lo tanto, pretendía solicitar multitud de pruebas de seguridad y toxicidad, como si se trataran de vacas transgénicas, como si fueran animales modificados genéticamente. Una y otra vez Recombinetics repitió que lo único que habían hecho con ayuda de las herramientas TALEN de edición genética era substituir una variante genética por otra, de forma precisa, de forma limpia, sin añadir ni introducir ningún otro gen o fragmento de ADN en el genoma de las vacas editadas resultantes. Y que las dos variantes existían ya en la naturaleza, que no habían inventado nada. De hecho, en abierto desacuerdo con la FDA, lo cierto es que Recombinetics nunca solicitó formalmente la aprobación de estos animales en EEUU.

Pero no era así. Las vacas editadas sí eran transgénicas. Gracias a unos análisis fortuitos, realizados en la FDA y depositados en el servidor de artículos compartidos bioRxiv, usando la información genética de los genomas editados de estas terneras Holstein editadas (información que los investigadores de Recombinetics habían puesto a disposición de cualquier otro investigador interesado), acabamos de conocer que el genoma de las vacas editadas (en particular el genoma de Buri, el que se analizó) no está tan intacto como pensábamos. Un gran fiasco. Una decepción y un gran problema para Recombinetics, y para todo el sector biotecnológico.

¿Qué había pasado? Lo ocurrido lo explican estupendamente Norris y otros colaboradores de la FDA en su estudio. Las herramientas de edición genética se pueden introducir en los embriones y en las células en diferentes formatos. Lo más sencillo, lo que primero se desarrolló, fue el uso de plásmidos, moléculas de ADN circulares fáciles de crecer en bacterias y fáciles de introducir en células mediante procedimientos de transfección. También se pueden usar molécular de ARN, portadoras de la información, o, en el caso de las nucleasas, directamente proteína recombinante. Los investigadores de Recombinetics usaron ARN para introducir la región codificante para las herramientas TALEN y un plásmido para proporcionar el ADN molde que contenía la duplicación que esperaban introducir, por recombinación homóloga, en el locus HORNED para convertirlo en la variante mutante POLLED. Se esperaba que la molécula de ARN de TALEN se tradujera (de ARN a proteína), y que el plásmido con el ADN molde se usara solamente para aportar la secuencia a usar en la corrección, en el pegado del corte producido por la TALEN. Y nada más. Los plásmidos portadores del ADN molde debían haber desaparecido tras el evento de edición, no debían haberse insertado. Pero se insertaron en el genoma de las células editadas.

Inserción inesperada de secuencias del plásmido usado para aportar el ADN molde en uno de los dos alelos editados (panel C de la figura extraída del trabajo Norris et al. depositado en bioRxiv 28 de julio de 2018).

El uso de plásmidos de ADN para introducir herramientas de edición genética ZFN, TALEN o CRISPR, o de ADN molde, en plantas es habitual. Es el procedimiento normal. Y no se asume que los plásmidos no se vayan a integrar. De hecho frecuentemente se integran en el genoma de las plantas editadas resultantes. Y es entonces labor del investigador el proceder a segregar en las siguientes generaciones el gen editado (que es lo que interesa) de cualquier resto de plásmido que hubiera podido integrarse. Hasta conseguir semillas y plantas que solamente tengan la variante editada, y ninguna otra inserción ni modificación en el genoma. Claro, el obtener sucesivas generaciones es relativamente sencillo de obtener en plantas. Es mucho más costoso y lento en animales, y requiere mucho más tiempo, especialmente con animales de granja, como las vacas, que habitualmente no suelen ponerse a cruzar hasta pasados 15 meses tras su nacimiento.

En animales se suelen evitar, en lo posible, los reactivos ADN, precisamente por su riesgo de integrarse en el genoma. Se suelen utilizar construcciones directamente ya de ARN o de proteínas recombinantes, para las nucleasas, y moléculas de cadena sencilla (monocatenarias) de ADN para aportar el molde que se pretende usar en la edición. Ahora bien, en células animales la transfección de ARN, proteínas o ADN de cadena sencilla es técnicamente complicada. Por eso muchos laboratorios siguen optando por transfectar plásmidos de ADN. Exactamente como hicieron los investigadores de Recombinetics. Lo que resulta sorprendente es que, más allá de confirmar la presencia de la duplicación deseada, y a pesar de contar con la secuenciación genómica completa de los clones de fibroblastos editados (información que ha sido utilizada por la FDA años después para encontrar el error) no se dedicaran a revisar, cuidadosamente, si se habían introducido secuencias del plásmido en el proceso de edición. Deberían haber revisado diversos clones editados para acabar seleccionando aquel que no tuviera inserciones no deseadas. Por el contrario optaron por confirmar la presencia del alelo editado, la no existencia de otras secuencias parecidas modificadas (off-targets), y no revisaron ni se percataron de la presencia de una copia entera del plásmidos y de otra duplicación del ADN molde que se habían insertado a continuación en el genoma, en uno de los dos alelos. Un fallo importante del control de calidad que ahora asumen los responsables de Acceligen, la empresa derivada de Recombinetics que se ha hecho responsable de estos animales.

¿Qué puede suceder debido a la inserción de estas secuencias plasmídicas? Probablemente nada. Pero es preocupante que se introduzcan genes de bacterias, en especial de resistencia a antibióticos (Ampicilina/Kanamicina) usados en los procesos de selección en bacterias, y aunque improbable, no es imposible que estos genes de resistencia pudieran saltar a las bacterias que viven en el interior del cuerpo de las vacas editadas. Sabemos que la presencia de genes procariotas insertados en genomas eucariotas suele producir alteración y hasta el silenciamiento de los genes eucariotas colindantes. En cualquier caso, estas secuencias no deberían haber llegado nunca a formar parte del genoma de la vaca. Se deberían haber detectado estos clones erróneamente editados y haber sido descartados. En su lugar, se deberían haber seleccionado clones de fibroblastos editados que portaran solamente la edición planeada, y nada más. Como se puede apreciar en los resultados de los investigadores de la FDA, solamente uno de los alelos está erróneamente editado. Así pues, solamente la mitad de la descendencia del toro Buri (Spotigy fue sacrificado para ser analizado) transmitirá el alelo correcto POLLED a su descendencia. Pero ya será inevitable admitir que para su generación se habrían generado animales transgénicos, lo cual, desde el punto de vista regulatorio, reviste una extraordinaria importancia (son animales transgénicos, genéticamente modificados, bajo todos los puntos de vista) y echa por tierra la precisión y limpieza del proceso, autoproclamadas por la empresa. De hecho nadie cree que la empresa vaya a solicitar ahora aprobación por parte de la FDA. Y al aparecer una solicitud de aprobación similar para estos animales en Brasil ya ha sido denegada.

En Europa, a finales de julio de 2018, el Tribunal de Justicia de la Unión Europea dictaminó que los organismos editados genéticamente debían ser considerados transgénicos y, como tales, estar sujetos a todas las pruebas y tests de toxicidad y seguridad que se exigen actualmente a cualquier organismo modificado genéticamente (y que, de facto, han bloqueado el desarrollo de organismos transgénicos en Europa). Fuimos muchos quienes nos revelamos contra esa decisión, sin fundamento científico, al considerar que la edición genética no era equivalente a una transgénesis, al no introducir nuevas secuencias de otros organismos, sino variantes ya existentes en la naturaleza. Pero claro, para ello debe cumplirse que la planta o el animal editado no sea transgénico por otros motivos. La mayoría de plantas editadas son transitoriamente transgénicas durante el proceso de edición, hasta que se eliminan las construcciones integradas con las herramientas de edición, por segregación, y se seleccionan solamente aquellas plantas que tienen la edición deseada y nada más. Estas últimas no deberían estar sujetas a la misma regulación como otras plantas transgénicas, aunque desde la Unión Europea se argumenta (de forma parecida a la FDA) que debido a que se ha usado transgénesis durante el proceso de edición estas deberán estar sujetas a las mismas pruebas y verificaciones como el resto de plantas transgénicas (a pesar que no quede ni rastro de los transgenes en las plantas finalmente editadas).

Los aproximadamente 17 descendientes de Buri se distribuyeron entre Minnesota, California y Australia, en diferentes centros colaboradores de Recombinetics. Nadie se percató de la presencia inesperada de estas secuencias indeseadas de ADN bacteriano en la mitad de los hijos de Buri (la otra mitad habría heredado la mutación POLLED limpia). Según indica el artículo de MIT Technology Review la mayoría de animales que quedaban en California ya han sido incinerados.

Un triste final para un experimento de edición genética en animales que se presentó como paradigmático y ejemplar. Y una nueva lección para aprender (o para reforzar nuestras convicciones) para todos los científicos que nos dedicamos a la edición genética. La de revisar a conciencia el genoma de los organismos editados antes de concluir que solamente contienen las alteraciones planeadas.



19 Comentarios

  1. Gran artículo y enhorabuena por la apertura del blog. Me quedo con la importancia de rectificar en ciencia y de asumir los errores que, como dices, son inevitables.

    1. Muchas gracias. En efecto, es inevitable cometer errores. Pero cuando se encuentran hay que explicarlos, compartirlos y tratar de evitarlos, para no volver a cometerlos. Sera duro para esta empresa pero han empezado bien, asumiéndolo y comentando lo obvio, que no se dieron cuenta, que se les pasó revisar este aspecto tan relevante. Te aseguro que no les va a volver a pasar. Ni a ellos ni a otras empresas del sector.

    2. Muchas gracias, todos nos equivocamos. Eso no lo podemos evitar. Pero cómo reaccionamos ante los errores es lo realmente importante. En Ciencia la transparencia implica compartir éxitos y fracasos. De todo se aprende.

  2. Toda esta histeria regulatoria antitransgénicos es de lo más estúpido que he visto en muchos años. Continuamente se crean nuevas razas por selección tradicional, con cientos o miles de genes modificados con respecto a la raza o razas originales, y con total desconocimiento de cuáles son y cómo se han modificado, y nadie les exige los draconianos controles que les piden a los transgénicos, en los que se modifican poquísimos genes y que se sabe cuáles son y cómo se han modificado.

    En definitiva, más que un fiasco de la edición genética, es un fiasco, y gordísimo, de la política.

    1. Pues también tienes razón Antonio. Personalmente me molesta/sorprende más que no se haya detectado este error a tiempo (que podría haberse detectado) más que finalmente haya llegado a las vacas editadas. Como digo en el artículo, desde un punto de vista científico las consecuencias de este error probablemente sean nulas o insignificantes. Esencialmente en dos generaciones tienen el problema resuelto, seleccionando solo aquellos descendientes que hayan heredado el alelo mutante limpio. Pero desde el punto de vista regulatorio es un gran fiasco, especialmente por toda la historia previa de la compañía, que insistió ante la FDA de la limpieza y precisión de la edición realizada. Ahí está el problema, en mi humilde opinión.

  3. Un artículo muy interesante. Yo creo que estos intentos ponen en evidencia michas cosas. Por una parte la sin duda necesaria escrupulosidad de los protocolos para evitar caer en errores previsibles y sobre todo no dar lugar al potenciamiento de restricciones de índole política y popular. Y por otra parte el increible potencial de estas líneas de investigación.

  4. Muchas gracias Lluis por iniciar este blog. Para mi tus artículos sueltos en Naukas son la mejor fuente de información que he encontrado para formarme una opinión sobre modificación genética, así que estamos de enhorabuena con el paso que has dado.
    Te honra haber empezado precisamente con este artículo. Después de leerlo, opino que son necesarios controles sobre los organismos editados, entiendo que no es necesario un control de seguridad y de toxicidad si resulta posible comprobar que no hay transgenesis. Los promotores tienen un sesgo de confirmación muy grande, ya que es su trabajo dar resultados, como queda patente en este caso. Me parece que la FDA ha hecho un gran trabajo.
    Muchas gracias nuevamente, por haberme dado a conocer y entender todo el asunto.

    1. Muchas gracias César, te agradezco tus comentarios. Entiendo que puede ser difícil a veces comprender todo lo que ocurre alrededor de los organismos modificados genéticamente. Desde este blog intentaré aportar mi granito de arena para facilitar esta comprensión y promover el debate con argumentos y evidencias científicas.

  5. Lluís
    Extraordinario articulo , un gozo leerte y de acuerdo contigo ; ante todo el rigor científico debe imperar no solamente en la edición genética sino en toda la experimentación.

  6. En los casos de edición genética mediante transgénesis, debería existir la obligación legal de realizar análisis que demuestren que no han sido creados organismos transgénicos. La aplicación de dicha ley no solo evitaría comportamientos gravemente negligentes como el de la empresa Recombinetics, sino que tanto la FDA como sus homólogos de la Unión Europea se verían obligados a abandonar su irracional equiparación entre organismo editado y organismo transgénico.

    1. La edición genética que implica transgénesis (introducción de un nuevo fragmento de gen o un nuevo gen en un organismo) de hecho ya está cubierta por la misma directiva europea de 2001 tras la sentencia del Tribunal de Justicia de la Unión Europea de julio de 2018.Y el completo dossier de experimentos y test que se solicita incluye lo que comentas. Gracias por tu comentario!

  7. Enhorabuena por el nuevo blog; genética y ética -el logotipo del nombre, muy bueno- son reflexiones imprescindibles en los nuevos avances de ingeniería genética y biomedicina.
    Y un magnífico artículo para comenzar; exponiendo un error, explicarlo fenomenalmente y hacernos entender todos los cuidados que experimentador y técnicas deben aplicar.

    1. Muchas gracias Marisa, reitero contigo lo importante que sois el colectivo de profesores de institutos de enseñanza secundaria para trasladar cómo progresa de verdad la ciencia a nuestros jóvenes, con sus éxitos, y también con sus fracasos. Muchas gracias por tus amables palabras. Un abrazo!

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Por Lluis Montoliu
Publicado el ⌚ 2 septiembre, 2019
Categoría(s): ✓ edición genética
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