Edición de calidad (PRIME EDITING): la nueva herramienta CRISPR para colorear

Por Lluis Montoliu, el 22 octubre, 2019. Categoría(s): edición genética • genética • terapia génica ✎ 21
Interpretación gráfica simplificada de la nueva herramienta quimérica CRISPR para PRIME EDITING (PE) (para editar con calidad) creada por el laboratorio de David Liu (BROAD Institute). Basado en la publicación de Anzalone et al. Nature (2019). doi:10.1038/s41586-019-1711-4. La guía sintética original (sgRNA) se convierte en una molécula extendida (pegRNA, del inglés “prime editing guide“, o guía de edición de calidad) cuya otro extremo se usa para aparearse con la otra cadena de DNA y poder dirigir la síntesis de nuevo DNA a partir del RNA, gracias a la actividad transcriptasa reversa asociada a la proteína Cas9 nickasa, que solamente abre el ADN en una de las cadenas, la que debe extenderse. El RNA puede incluir pequeñas variaciones o mutaciones (en violeta) que son posteriormente copiadas al DNA generados de nuevo (en gris). Esquema realizado por Lluís Montoliu.

En el universo CRISPR ya casi no nos quedan fuerzas para seguir sorprendiéndonos con alguna de las múltiples novedades que regularmente van apareciendo por doquier de estas maravillosas herramientas de edición genética. Estamos agotados de sorprendernos. Hemos anunciado tantas veces que las nuevas variantes o novedades CRISPR eran un cambio substancial, inesperado, impresionante, un “game changer” como dicen los anglosajones, algo que cambia las reglas del juego, que nos queda poco margen ya para entusiasmarnos a la hora de anunciar una gran novedad, de las de verdad, como la que hoy publica el laboratorio de David Liu, investigador del BROAD, en la revista Nature.

Y sin embargo así es. Tenemos que sorprendernos y quitarnos el sombrero. Este gran investigador lo ha vuelto a hacer. Es el mismo David Liu que sorprendió al mundo con los editores de bases (BE), (que podríamos describirlos como un corrector Tippex molecular, aquella pasta blanca que borra una letra incorrecta y luego podemos escribir encima la letra correcta). Los editores de base son una deliciosa proteína quimérica de síntesis en la que situó una actividad deaminasa (una conversión química que permitía convertir una A en una G, o una C en una T) sobre un determinado nucleótido (sobre una determinada letra) gracias al posicionamiento de la nucleasa Cas9 (en su version dead-muerta/inactiva, o nickasa, la que solo corta una cadena de ADN, en lugar de las dos cadenas) y de la guia de ARN correspondiente, sin necesidad de cortar el ADN. Aquello sucedio en 2016 y rápidamente generó unas expectativas terapéuticas tremendas. Liu preparó sucesivas versiones (hasta la última, mejorada, BE4) pero últimamente los editores de bases andaban de capa caída, tras comprobarse que parecen sustentar también cambios no deseados en secuencias genómicas parecidas (las famosas mutaciones off-target que llaman los ingleses) a un nivel considerable, tanto en plantas como en animales, principalmente los editores de bases que cambiaban la C por la T, lo que fue una decepción para muchos (me incluyo entre ellos). Naturalmente también para David Liu, quien junto a Feng Zhang y J. Keith Joung habían lanzado una empresa (Beam Therapeutics)  para explorar, y eventualmente comercializar, el potencial terapéutico de estos editores de bases.

Probablemente espoleado por la decepción que había causado en el campo la aparición de de estas mutaciones no deseadas difícilmente gobernables en los editores de bases debió decidir retirarse al rincón de pensar hasta que imaginó, hasta que creó una nueva proteína quimérica. Esto está al alcance de muy pocos mortales. La mayoría de nosotros conocemos las actividades de las proteínas y contamos con ellas para realizar las funciones que les son propias. Pero raramente se nos ocurre mezclar actividades ni proteínas no relacionadas para crear nuevas funciones que no han sido ni imaginadas por la evolución. Esto es, nada más y nada menos, lo que ha hecho Liu en esta nueva publicación de su laboratorio.

David Liu ha juntado una variante nickasa de la proteína nucleasa Cas9, que corta una cadena de ADN (pero no las dos, como lo hace la Cas9 normal), que ya describió Feng Zhang en 2013, con una actividad nueva e inesperada, una transcriptasa reversa o inversa (RT, del inglés reverse transcriptase). Sí, la misma sctividad que tiene la telomerasa o las RT de los retrovirus/lentivirus. Pero ¿cómo se le ocurrió mezclar peras con manzanas? ¿Cómo se le ocurre mezclar una nucleasa (que posiciona y corta el ADN), con una actividad RT?, que es capaz de sintetizar ADN a partir de ARN, invirtiendo (de ahí el nombre) el flujo natural de la información genética, almacenada en el núcleo en forma de ADN, transcrita a ARN, que es la molécula que traslada la información del núcleo al citoplasma para ser finalmente traducida en forma de proteína (ADN->ARN->Proteína). Pues bien, las RT son capaces de sintetizar ADN desde el ARN, es decir: ARN->ADN.

¿Dónde está el truco? ¿Por que de repente nos hemos vuelto todos locos con esta nueva invención de Liu?

El truco está en usar en una nueva guía de ARN muy larga, que llaman pegRNA (del inglés prime editing guide RNA). Esta guía ahora cumple dos funciones. Por un lado (el extremo 5′ del ARN guía) sigue teniendo su función de posicionar la Cas9 en un determinado sitio del genoma, sobre nuestro gen favorito que queremos editar. Pero por el otro lado (el extremo 3′), extendido, se convierte en una cola mucho más larga que lo normal, que además de unirse a la proteína Cas9 consigue que ese nuevo extremo de la guía ahora actúe de molde para la síntesis de la otra cadena de ADN, síntesis que naturalmente lleva a cabo la transcriptasa reversa o RT que hábilmente ha asociado Liu a la proteína Cas9. Esta extensión de la guía ARN en su extremo 3′ puede tener las mutaciones o correcciones de mutaciones que quieran incorporarse en el locus determinado (el cuadradito violeta de la figura que encabeza este artículo). Y esta será la mutación que se incorporará o se corregirá, según corresponda. Lo más importante: pues que ya no hay necesidad de aportar un ADN molde, de ADN donador que sirva para reparar el corte de la nucleasa Cas9 y aporte las secuencias que queremos editar (como funciona el sistema CRISPR-Cas9 tradicional). Ahora ya no es necesario. El papel del molde ahora lo hace la misma guía de ARN, pero en su otro extremo libre. Fascinante. Sorprendente. ¡Y funciona! Si revisáis la figura adjunta os haréis probablemente una idea de lo que puede hacer esta nueva herramienta, y cómo lo hace. Tras extender el ADN y desaparecer las proteínas y el ARN finalmente se repara la doble cadena incorporándose en la cadena complementaria la letra que le corresponde, para aparearse con la(s) nueva(s) introducida(s). La nucleasa Cas9 que usan no es la tradicional, ni  tampoco es la muerta o inactiva (dead Cas9, dCas9) sino que es una Cas9 nickasa, porque necesitan cortar al menos una cadena para promover el cambio y la edición (ver la figura adjunta que encabeza este artículo). Esta nickasa corta la cadena de ADN que tiene la misma secuencia que la guía, es decir, la que se usará por el extremo opuesto de la misma para sustentar la síntesis de novo de ADN por la actividad RT ahora usando ARN como molde. Finalmente ese cadena de ADN extendida debe repararse y puede optar por repararse con la secuencia original o con la secuencia editada promovida por la guía de ARN. Hay que resaltar que no se corta el ADN en las dos cadenas, no se produce un DSB o double strand break, por lo tanto no se generan las múltiples reparaciones características del sistema CRISPR-Cas9 tradicional, a las que me refería en una entrada anterior de este blog sobre “El azar como terapia“.

Para comparar y ver las novedades del PRIME EDITING adjunto el esquema de lo que es la primera versión de las herramientas CRISPR-Cas9, en la que la guía de ARN (sgRNA) solamente dirige a la nucleasa Cas9 para que esta pueda cortar en las dos cadenas de ADN (DSB, double strand break, en inglés). Esquema realizado por Lluís Montoliu, incorporado en la CRISPR web at CNB.

De momento la edición con esta nueva herramienta ha funcionado solamente en células humanas en cultivo. Estos son los experimentos que se muestran en este artículo. Esencialmente en unas células que todos tenemos y todos usamos para casi todo en nuestros laboratorios, por lo agradecidas que son (HEK293). En esas células el sistema funciona muy bien y el hecho de añadir una actividad transcriptasa reversa a las células no parece afectarles significativamente. Con estas células han sido capaces de corregir los pequeños cambios que se requieren, asociados a las mutaciones causantes de la anemia falciforme y de la enfermedad de Tay-Sachs, han incorporado una variante protectora en el gen de la proteína priónica (causante de la nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob) y otras pequeñas variaciones. Sin embargo las eficiencias bajan en los pocos modelos de células primarias de ratón que prueba, que son células más difíciles de obtener y de cultivar. Bajan pero los resultados siguen siendo útiles y significativos. Las ediciones se obtienen con una menor variabilidad (menos INDELs) y con un menor número de mutaciones no deseadas en regiones similares del genoma (off-targets) que las obtenidas con la Cas9 tradicional.

El sistema es extraordinariamente versátil y, sobre el papel, permitiría tratar y corregir (añadir, quitar, substituir unas pocas letras) alrededor de un 89% de las mutaciones conocidas asociadas a enfermedades congénitas (que son más de 75,000, según consta en la base de datos de variantes genéticas humanas asociadas a enfermedad ClinVar). Un potencial espectacular. Potencial, esa es la palabra. Nada se ha demostrado ni en animales, ni por supuesto en pacientes. Todavía. Solamente en células en cultivo.

Tal maravilla tenía que tener un nombre a la altura. Esta generación de wonder boys (como Feng Zhang y David Liu) son bien conocidos tanto por su talento científico como por su habilidad natural para crear acrónimos o nombres interesantes, sugerentes, y con doble sentido. Esta nueva variante CRISPR no podía ser una excepción. PRIME EDITING (PE) es el nombre acuñado por David Liu que, por lo menos, puede traducirse de dos maneras (y estoy seguro que han jugado con su doble sentido en inglés). Por un lado el obvio de “edición gobernada por molde, o dirigida por molde”, pero por otro lo que tiene de especial esta nueva edición, que es mucho más certera, menos variables y menos propensa a la aparición de off-targets, es decir es una edicion PRIME, “de calidad”, como los servicios “PRIME” de una conocida empresa de mensajería, que son un plus sobre los servicios normales.

Creo que estamos ante un avance excepcional, con gran potencial pero que todavía debe demostrar su traslación terapéutica. Muy distinto a cualquier otra cosa que hayamos conocido hasta ahora. Es una nueva herramienta para la caja de herramientas. Una que no conocíamos y que tendremos que aprender a usar. Pero debemos activar el gen de la prudencia. Ahora hay que esperar a que esta maravilla circule entre laboratorios, que otros la prueben y constaten su eficacia. Conociendo a David Liu seguro que ya habrá depositado el plásmido con el gen de la proteína quimérica en AddGene o lo depositará pronto (en el apartado de reactivos de su laboratorio que tiene depositados), de la que no hay una sino ya por lo menos tres versiones, la tercera de las cuales PE3 es la que genera los mejores resultados.

A este tipo de actividades nuevas me refería en mi libro “Editando genes: recorta, pega y colorea“. A colorear. A crear nuevas actividades que se asocian a variantes de la proteína Cas9 que posiciona estas nuevas actividades en el lugar indicado del genoma. Naturalmente esta actividad PE formará parte de la nueva edición del libro que ya estamos preparando en Next Door Publishers y que confíamos poder traducir a otros idiomas.

Hay que disfrutar de la magia de David Liu. Hay que descubrirse ante esta idea tan original que transpira todo este trabajo, pero hay que mantener la calma. También los editores de bases parecían muy prometedores, hasta que se encontró que generaban muchos cambios no deseados en otros sitios del genoma. Esperemos que estas nuevas herramientas de PRIME EDITING no nos den sorpresas adicionales. Pero habrá que estar atentos. Y habrá que contarlo. Aquí estaremos.



21 Comentarios

  1. supgongamos que tengo un problema de un “cambio de base” (C por G) supongamos que tengo animales modelos con esa mutación. Supongamos que sólo necesito un investigador que pruebe en esos modelos. ¿cuanto se tardaría en probar en modelos de peces cebra y cuanto costaría?

    1. Esto que describes Diego es un típico y clásico proyecto actual de edición genética de validación de modelos animales para el estudio de una patología determinada. Son proyectos que se pueden ejecutar en unos 3 años (para iniciar los experimentos) y costarían aproximadamente unos 500.000 euros, si se financiara todo lo necesario, pero que frecuentemente acaban siendo infrafinanciados y, en el mejor de los casos, se consiguen de 200 a 250.000 euros, como contaba hace poco en un artículo que escribí para el Cuaderno de Cultura Científica de la UPV/EHU.
      https://culturacientifica.com/2018/02/23/cuanto-cuesta-realmente-investigar-en-biomedicina/

    1. Efectivamente, siguen apareciendo INDELs y mutaciones no deseadas en secuencias similares (off-target), pero en menor medida. Y, totalmente de acuerdo, habrá que seguir investigando.

  2. Muy interesante el descubrimiento y muy bien explicado aunque para alguien q ha tenido que aprender de genética a la fuerza me ha costado comprender el funcionamiento.
    Esperemos que pronto sirvan estas tecnologías para curar enfermedades, tengo un niño de 6 años con dm1 y espero con ansia que estos avances lleguen a las clínicas.

    1. Gracias Jose. Este es el motor de muchos investigadores y lo que nos hace seguir trabajando para aprender más sobre estas herramientas nuevas de edición genética y su posible futuro uso terapéutico. Hay que obtener herramientas terapéuticas eficaces y, sobre todo, seguras.

  3. Me parece encantador el hecho de la investigación hasta ese lugar tan profundo
    Ahora bien, van al genoma y aun no comprender las funciones de la especie humana integra.
    Ojala sirva para algo que sume
    Es muy sabio Liu

  4. Ya se estamos en los inicios de la computación cuántica
    Es cuestión de tiempo para q dichos aparatos comiencen a mejorar el desarrollo molecular artificial

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