Encendiendo y apagando genes con un antibiótico

Por Lluis Montoliu, el 9 agosto, 2020. Categoría(s): divulgación científica • experimentación animal • expresión génica • genética • historia de la ciencia • pigmentación • transgénesis ✎ 3
El operón Tetraciclina en bacterias. En ausencia del antibiótico (tet) el represor /(TetR) permanece unido a secuencias operadoras (tetO) de los genes tetR y tetA, impidiento su transcripción. Tan pronto aparece la tetraciclina en el medio intracelular se combina con un catión de magnesio y se une al represor TetR, que cambia de configuración y se libera del operador, reactivando así tanto la producción de más represor como la síntesis de TetA, que bombea el antibiótico al exterior. Esquema de Wikipedia Commons.

El día 31 de julio de 2020, hace algo más de una semana, falleció el investigador alemán Hermann Bujard a la edad de 86 años. Bujard fue un prestigioso biólogo molecular del Centro de Biología Molecular de Heidelberg (ZMBH), del cual fue también su Director. A no ser que seas biólogo molecular es posible que este nombre no te suene. Sin embargo es uno de los científicos más influyentes en la biología molecular moderna y quien diseñó y mostró al mundo que los genes de cualquier ser vivo podían encenderse y apagarse a voluntad usando un antibiótico. Por eso creo que hay que conocerlo y explicar lo que hizo, y por eso he escrito este artículo. Es un nuevo ejemplo de como en biología molecular las bacterias (los procariotas en general) han sido y siguen siendo fuente inagotable de recursos, de mecanismos, de sistemas de control de la expresión génica, que aprovechamos luego para aplicarlos en eucariotas.

La capacidad de que un gen se exprese en tal o cual tejido depende de las secuencias promotoras/reguladoras que le incorporemos, que determinarán que aquel gen se exprese en el hígado, en el cerebro o en el riñón, por ejemplo. Esta es la base de transgénesis animal y ha producido, de esta manera, miles de modelos animales modificados genéticamente. Pero eso solamente implica controlar la expresión en el espacio, dónde queremos que el gen/transgén se exprese. ¿Qué ocurre cuando queremos controlar la expresión de un gen en el tiempo, cuando queremos encenderlo o apagarlo? Ese ha sido un reto constante en biología para el cual se han propuesto diversas soluciones. De todas ellas, la más imaginativa, la más eficaz, y, todavía hoy, la que mejor funciona fue la propuesta de Hermann Bujard, que sugirió en 1992 utilizar prestado algunos elementos del operón procariota de la tetraciclina y trasladarlos a cualquier otro ser vivo. De nuevo, como con las herramientas CRISPR, las bacterias ayudando a los eucariotas y trasladando sistemas de expresión génica inventados por las bacterias hace millones de años para usarlos en múltiples aplicaciones biotecnológicas.

Las tetraciclinas son un grupo de antibióticos, producidos por algunas bacterias, que funcionan como bactericidas, es decir, matan a otras bacterias al inhibir la fosforilación oxidativa (la cadena respiratoria) y la síntesis de proteínas, entre otras actividades conocidas. La resistencia a estos antibióticos la adquieren fácilmente las bacterias al incorporar plásmidos o transposones (como Tn10) que portan el operón Tetraciclina, que es el que confiere resistencia a este antibiótico, esquematizado en la primera figura de este artículo. El operón Tet es todo un prodigio de funcionamiento. Si no está presente el antibiótico tetraciclina (Tet) en el medio la bacteria mantiene el operón apagado, gracias a la acción de una proteína represora (TetR), que reprime la propia expresión del gen (tetR) y la de otros genes, como tetA, que codifica una proteína transportadora (TetA) capaz de expulsar el antibiótico fuera de la bacteria. Tan pronto aparece Tet se combina con cationes de magnesio (Mg2+) y a su vez con la proteína represora TetR que cambia de forma al unirse a Tet, y se despega de las secuencias operadoras (tetO) que la mantenían reprimiendo los genes tetR y tetA. El resultado es que Tet empieza a ser bombeada fuera de la célula bacteriana, que logra sobrevivir a este antibiótico. Un sistema estupendo de resistencia a antibióticos.

Hermann Bujard (1934-2020) impartiendo una conferencia tras recibir la Medalla de Oro Robert Koch que le otorgó la Fundación Robert Koch en 2014 (Fotrografía: David Ausserhofer).

Herman Bujard conocía bien el operón Tet. Desde sus tiempos como investigador postdoctoral en EE.UU. estaba interesado en desarrollar algún sistema que permitiera controlar la activación (y la represión) de genes a voluntad del investigador, en otras palabras, un sistema inducible. Este fue, durante años, el Santo Grial de la biología molecular al que muchos científicos dedicaron su tiempo y talento, a la búsqueda de algún sistema heterólogo (que no interfiriera con los sistemas endógenos celulares), que no fuera tóxico, que fuera reversible y que permitiera modular la respuesta en un amplio rango, de forma proporcional a la dosis de molécula efectora que se utilizara. Todas estas características, deseables para un sistema inducible, las cumplía el sistema que las bacterias usaban para responder a la agresión de un antibiótico y, por ello, imaginó y diseñó, junto a su colaborador Manfred Gossen, un sistema para encender y apagar genes a voluntad basado en el operón Tet. Se conocían otros sistemas inducibles, como el que respondía a cationes de metales pesados (Cd2+) o el que respondía a hormonas esteroideas, pero, en ambos casos, además del gen que se deseaba regular, resultaban afectados otros muchos, que también se regulaban endógenamente por metales pesados o esteroides. Por eso el sistema de la tetraciclina era tan prometedor. Porque Tet era una molécula que no interaccionaba con las células eucariotas ni afectaba a ningún proceso metabólico endógenos de la célula eucariota. Por eso Gossen y Bujard decidieron usar el operon Tet del transposón Tn10 de Escherichia coli, adaptado para su uso en células eucariotas. Su artículo publicado en la revista PNAS en 1992 fue toda una revolución, y sigue siendo hoy uno de los más citados en biología molecular.

Los dos sistemas inducibles diseñados por Hermann Bujard basados en el operón Tet bacteriano. A la izquierda, el primero de ellos (tTA / TET-OFF), lanzado en 1992, mediante el cual se activa la expresión de un gen en ausencia del antibiótico. A la derecha, el segundo de ellos (rtTA / TET-ON), lanzado en 1996, mediante el cual se activa la expresión de un gen en presencia del antibiótico. VP16 es la proteína viral 16 del virus del herpes simple (HSV). TetR es el represor del operón de la tetraciclina. TetR’ es una variante mutante que funciona al revés. TRE es un conjunto de secuencias tetO a las que se une el represor TetR y TetR’. Esquema realizado por Lluís Montoliu.

Para convertir algunos elementos del operón Tet en un sistema inducible universal lo primero que hizo Hermann Bujard fue convertir un represor en un activador. A la proteína TetR, el represor del opertón Tet, le añadió el dominio activador de la proteína viral 16 (VP16) del virus del herpes simple (HSV). Construyó unas secuencias TRE (del inglés, Tetracycline Responsive Element, elementos de respuesta a tetraciclina) que contenían múltiples copias de las secuencias tetO a las que se unía la proteína represora TetR. y situó la secuencia TRE en la cercanía del promotor de un gen cuya expresión se quería regular. Ese fue el primer sistema inducible que desarrolló Bujard en 1992, llamado originalmente tTA (por tetraciclina-TransActivador) y que posteriormente se conoció con el nombre comercial de TET-OFF, a través de la empresa que estos investigadores crearon a tal efecto, llamada TET SYSTEMS. En esta primera versión del sistema inducible la expresión del gen ocurría en ausencia del antibiótico, del efector. En su presencia lo que se provocaba era la inactivación del gen, al unirse el antibiótico al represor y provocar un cambio conformacional de estructura que hacía que la proteína ya no encajara ni se acoplara con las secuencias TRE, que contenían los elementos tetO.

Aunque inicialmente se usó el antibiótico tetraciclina muy rápidamente se comprobó que eran mucho más eficaces y menos tóxicos sus derivados anhidrotetraciclina y, sobre todo, la doxiciclina, que es el antibiótico de preferencia que se usa actualmente en todos estos sistemas de inducción / represión de la expresión génica basados en el operón Tet.

El sistema original tTA / TET-OFF era muy sensible pero, de alguna manera, era contraintuitivo, lo opuesto a lo que un investigador esperaría. Para que ocurriera algo (la activación de un gen) había que dejar de administrar el antibiótico. Por eso Bujard generó muchos mutantes del gen tetR buscando uno que se comportara de manera inversa, que en lugar de liberarse de la secuencia tetO se uniera a ella en presencia del antibiótico. Finalmente encontró un mutante (TetR’) con esas características y, con él desarrolló el sistema rtTA (por reverse tetracycline trans-activator) que se conoció con el nombre comercial de TET-ON. En este caso, en ausencia del antibiótico el gen a regular se mantenía apagado, y tras administrar antibiótico se lograba activar el gen. El sistema TET-ON lo describió Bujard en 1996 y fue rápidamente utilizado en la generación de muchos modelos animales modificados genéticamente, de muchos ratones transgénicos, como el que generamos en mi laboratorio para inducir la expresión del gen de la tirosinasa en ratones albinos.

¿Cómo se usa el sistema de expresión génica inducible por tetraciclina en ratones transgénicos? Hay que diseñar dos construcciones génicas y generar sendos ratones transgénicos con cada una de ellas. La primera (ratón transgénico 1) expresará el gen que deseamos activar (gen X) bajo el control de las secuencias de respuesta a tetraciclina (TRE) de forma ubícua, por todo el cuerpo. La segunda (ratón transgénico 2) expresará, en este caso la proteína rtTA (TET-ON) bajo el control de un promotor específico de cerebro. Los dos ratones transgénicos se cruzarán entre sí y, en la descendencia, en aquellos individuos que hayan heredado ambos transgenes, si los exponemos al antibiótico doxiciclina (por ejemplo en el agua de bebida, o en la comida) lograremos inducir la expresión del gen que queríamos (gen X) en el tejido que queríamos (en el cerebro, que es donde está expresándose solamente la proteína activadora rtTA, que es la que se unirá a las secuencias TRE y promoverá la expresión de nuestro gen X). Esquema realizado por Lluís Montoliu.

Los sistemas inducibles basados en el sistema de la tetraciclina se han usado en múltiples tipos celulares, en mamíferos, en plantas, en levaduras, en peces,… en multitud de especies, siempre con robustez y con gran éxito. Hermann Bujard nos ha dejado pero su contribución científica permanecerá para siempre con nosotros. Los últimos años de su laboratorio de investigación en el ZMBH los dedicó a desarrollar una vacuna contra la malaria, investigaciones por las cuales recibió la medalla de Oro de la fundación Robert Koch en 2014. Por ello resulta una exquisita coincidencia que otros investigadores usaran su sistema tTA / TET-OFF para diseñar unos mosquitos transgénicos, mantenidos en doxiciclina, que, cuando se liberaban al medio ambiente (sin antibiótico) activaban los genes y la sobreexpresión del represor-activador tTA provocaba una «catastrofe transcripcional» que acababa con la vida de los mosquitos, poco después de haber tenido ocasión de procrear y transmitir el transgen a la descendencia, que moría sin tener ocasión de nacer. Esta es una estrategia de control de la malaria y otras enfermedades infecciosas transmitidas por insectos muy interesante, que describiré en otro artículo próximamente.

Hace un mes comenté en este blog también el fallecimiento de otro gran investigador, mi mentor Günther Schüz, que trabajó a pocos metros de Bujard (para los que no hayan estado en Heidelberg, el DKFZ donde trabajó Schütz y el ZMBH donde trabajaba Bujard son edificios contiguos, separados apenas por unos pocos metros, en el campus Neuenheimer Feld de la Universidad de Heidelberg). Günther y Hermann eran muy buenos amigos, y los postdocs de ambos grupos teníamos muy buena relación. Bujard acudió al funeral de Schütz, poco antes ya de caer enfermo de forma irreversible. Yo tuve la fortuna de estar allí, en el laboratorio de Günther, cuando se describió este sistema de control inducible por tetraciclina. Recuerdo los seminarios mensuales del «Heidelberg Developmental Club» que lo formábamos investigadores de grupos del DKFZ, ZMBH, EMBL y MaxPlanck interesados en regulación de la expresión génica y en biología del desarrollo. Allí fue donde escuché por primera vez, de Manfred Gossen, el sistema inducible Tet.

Sirva este artículo como humilde homenaje a un gran investigador, Hermann Bujard, cuyo talento produjo sistemas de control de la expresión génica que seguimos usando hoy en día.



3 Comentarios

  1. Gracias por tu comentario, también denota tu personalidad. Para Hermann Bujard también mis agradecimientos por tan importante legado a la ciencia; permite avanzar en el tratamiento de muchas enfermedades.

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