El azar como terapia

Por Lluis Montoliu, el 6 octubre, 2019. Categoría(s): edición genética • genética • terapia génica ✎ 1
Gráfico resumen del artículo científico “NHEJ-Mediated Repair of CRISPR-Cas9-Induced DNA Breaks Efficiently Corrects Mutations in HSPCs from Patients with Fanconi Anemia” por Francisco José Román-Rodríguez y colaboradores en la revista Cell Stem Cell, https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.08.016

En biología, en la evolución, uno de los motores más importantes del progreso es el azar. Existen multitud de eventos estocásticos integrados en los procesos biológicos. Y, naturalmente, los caminos que busca y encuentra la evolución también vienen determinados inicialmente por eventos azarosos. El azar está pues presente en muchos ámbitos de las ciencias de la vida. Pero donde quizás no esperaríamos encontrar al azar es en una propuesta terapéutica innovadora. En principio imaginamos que una terapia debe ser algo extraordinariamente preciso y dirigido, encaminado a aquella solución singular que permita al sistema restaurar la funcionalidad normal. Pues no siempre es así. El equipo de la investigadora Paula Río (CIEMATCIBERER, Madrid) acaba de demostrar que es posible generar expectativas terapéuticas del azar. Fascinante. Veamos cómo.

Esquema general del mecanismo de edición genética mediada por las herramientas CRISPR. La nucleasa Cas9 produce un corte de doble cadena en el ADN (DSB) que debe repararse a través de una de las dos rutas principales: NHEJ (unión de extremos no homólogos) o HDR (dirigida por homología), lo cual resulta en la habitual disrupción o edición del gen que se pretendía editar. Esquema: Lluís Montoliu, de la página web: The CRISPR web page.

Uno de los problemas, no resueltos, de la edición genética es lo que ocurre después de que la nucleasa (p.e. Cas9 del sistema CRISPR-Cas9) corta el ADN en un lugar preciso del genoma, en nuestro gen favorito. Este corte de doble cadena (DSB, double strand break, en inglés) debe restaurarse lo antes posible, para evitar que en la próxima división la célula pierda un fragmento del cromosoma que puede contener genes esenciales para la vida. Existen dos procedimientos de reparación a los que puede acudir la célula para resolver el corte en el ADN: NHEJ y HDR, veamos qué hacen cada uno de ellos (revisad la figura adjunta).

Por un lado el sistema de emergencia, que se activa de inmediato, activo en todas las células, llamado NHEJ (unión de extremos no homólogos). Probablemente este sea el sistema de reparación más ancestral, muy efectivo, pero muy poco fiable. Se base en introducir (INsertar) y eliminar (DELetar) nucleótidos al azar, con la esperanza de que algunas As queden delate de Ts, o algunas Gs queden delante de Cs, y entonces, por los apareamientos de Watson y Crick (A-T y G-C) se logre restaurar la continuidad física del cromosoma, sellándose la herida causada en el genoma, aunque pagando el precio de haber alterado la secuencia del gen, al azar. Este procedimiento genera INDELs (inserciones y deleciones) de nucleótidos, por lo que, habitualmente comporta cambios substanciales en la secuencia del gen que conllevan su inactivación. Es un procedimiento de reparación que, habitualmente, provoca la disrupción del gen editado, lo cual tiene muchas aplicaciones en biología, biomedicina y biotecnología.

Por otro lado el sistema dirigido por homología (HDR), es el ideal, pues está dirigido por una molécula de ADN externa que actúa como molde y aporta los nucleótidos que deseamos incluir en la zona de corte. Es decir, dirige el cambio y provoca que, tras el corte, la edición de la secuencia del gen conlleve la creación de una nueva versión del gen, corrigiendo una mutación existente (terapia génica) o instaurando una mutación determinada en una ubicación precisa, en un modelo celular o animal de la enfermedad, tal y como hemos diagnosticado en un paciente.

El equipo de Paula Río acaba de publicar un artículo en la prestigiosa revista Cell Stem Cell donde demuestran que es posible usar la ruta de reparación azarosa (NHEJ) para corregir mutaciones que afectan a varios de los genes asociados a una enfermedad rara grave llamada Anemia de Fanconi, que se manifiesta principalmente en niños, y que cursa con un fallo de la médula ósea, incapaz de producir nuevas células de la sangre y la aparición de múltiples tipos de cáncer por todo el cuerpo de la persona afectada, lo que determina de forma muy significativa su calidad y esperanza de vida. Los genes de Fanconi codifican unas proteínas que están precisamente implicadas en los mecanismos de reparación del ADN. Sin ellas, las células son incapaces de reparar correctamente las mutaciones que constantemente se producen, de ahí la gravedad y la dificultad para estudiar y para proponer tratamientos para esta enfermedad.

Idealmente, a este equipo de investigadores del CIEMAT les hubiera encantado usar una estrategia de terapia génica con las herramientas CRISPR-Cas9 y promoviendo la ruta HDR para corregir las mutaciones en las células troncales hematopoyéticas de los pacientes de anemia de Fanconi. Mediante el uso de un ADN molde se podría substituir precisamente la mutación y restaurar la secuencia genética correcta. Pero eso no es posible, no funciona. Las correcciones mediadas por homología simplemente no son eficaces en estas células troncales de la sangre. Por ello, a estos investigadores solo les quedaba la otra ruta, NHEJ, a su disposición, pero con un altísimo riesgo, pues la corrección en esta otra ruta, recordemos, está gobernada por el azar.

Áplicación de una estrategia CRISPR-Cas9 asociada a NHEJ para corregir una mutación común en pacientes de anemia de Fanconi. Imagen modificada de la figura 2 del artículo Roman-Rodríguez et al. en Cell Stem Cell (2019).

Probaron su estrategia en diversas mutaciones y diversos genes, con éxito, pero quiero resaltar aquí uno de sus experimentos en el que obtuvieron los resultados, en mi opinión, más espectaculares e inesperados. Uno de los genes más frecuentemente afectados en anemia de Fanconi es el gen FANCA. En España, la mutación más común encontrada en pacientes de anemia de Fanconi es una substitución de una C por una T en la posición 295 del gen FANCA (se expresa c.295C>T). Este aparente pequeño cambio tiene profundas consecuencias. La información de nuestro ADN se transporta a través del ARN al citoplasma de la célula donde se traduce en forma de proteína. Cada tres nucléotidos del ADN de un gen forman lo que se llama un “codón” y acaban determinando que se incorpore uno de los 20 aminoacidos posibles durante la fabricación de esta proteína. Aunque también existen señales de control, que le dicen a la células dónde empezar a traducir una proteína (la señal son las tres letras ATG, que codifican para el aminoácido Metionina) y donde terminar la traducción de un gen (hay dos señales TAG y TAA), que cuando la célula las encuentra deja de añadir aminoacidos y da la proteína por terminada. La mutación c.295C>T en el gen FANCA determina que uno de los codones del gen que tenía la secuencia CAG (que determina la incorporación del aminoácido Glutamina) pase a leerse como TAG (que significa STOP, parada de traducción). Y entonces, claro, la proteína se trunca y se termina antes de llegar al final, por lo que ya no es funcional y aparece la enfermedad, se establece la anemia de Fanconi.

En la figura adjunta, de la publicación Roman-Rodríguez et al. Cell Stem Cell (2019) se observa que tras cortar cerca de la mutación c.295C>T con una herramientas CRISPR-Cas9 se producen múltiples intentos de reparación, al azar, mediante NHEJ. Insertándose y eliminándose nucleótidos, al azar. Entre las variantes reparadas que se obtienen estos investigadores descubrieron una proporción inicialmente casi insignificante de secuencias corregidas que habían eliminado 30 letras, a izquierda y derecha de la mutación a corregir. 30 es múltiplo de 3. Exactamente son 10 los codones que caben en 30 nucleótidos (10 x 3 = 30). Por lo tanto, al eliminar 30 letras al azar, de alguna manera, nos saltamos 10 codones, que ya no están, pero retomamos la lectura de la proteína con la misma pauta que teníamos inicialmente. Es decir, producimos una proteína FANCA que tendrá 10 aminoácidos menos, en su interior, pero que podrá leerse y completarse hasta el final. Y, lo que es más importante y no esperaban los investigadores: que esta proteína FANCA de menor tamaño es funcional, es capaz de restaurar la función FANCA afectada anteriormente por la mutación. ¡Sorprendente! ¡Bravo!

Los investigadores encontraron ese salto terapéutico de 10 aminoácidos, inicialmente solamente en el 0,20% de las células editadas. Pero 30 días después, tras cultivar estas células troncales hematopoyéticas editadas, resultó que la proporción de células que portaban esta corrección era ya del 14,91% y, a los 60 días, la proporción había llegado casi a la mitad de las células en cultivo (47,53%). Qué había sucedido? Que la corrección que había encontrado el propio sistema al azar había restaurado la función FANCA, antes afectada, y por ello, las células editadas con la supresión de esos 10 aminoácidos interiores, crecían y se multiplicaban mucho mejor que el resto, que seguían teniendo la mutación inicial c.295C>T o cualquier otra corrección no productiva, que no generaba proteínas funcionales. Habían corregido la mutación en el gen FANCA gracias al azar. Gracias al azar y a su talento al pensar que una estrategia NHEJ podría tener resultados terapéuticos. ¡Maravilloso!

Las dos rutas conocidas para la terapia génica. O bien se administra el tratamiento directamente sobre el paciente (IN VIVO), o bien se extraen células troncales del paciente que pueden crecerse en el laboratorio y, una vez corregidas, retornarlas al mismo paciente (IN VITRO). Esquema obtenido de internet.

Naturalmente este trabajo abre unas expectativas terapéuticas muy importantes para el tratamiento de la anemia de Fanconi y de otras muchas enfermedades que afectan a la sangre, siempre y cuando los genes que resulten afectados y deban corregirse confieran una ventaja selectiva a las células corregidas, frente a las células no corregidas, que paulatinamente serán apartadas por las primeras. El mismo equipo del CIEMAT-CIBERER, liderado por el Dr. Juan A. Bueren, acaba también de dar a conocer los resultados positivos de un ensayo clínico, publicados en la revista Nature Medicine, en el que han tratado a niños enfermos de anemia de Fanconi cuyas células troncales hematopoyéticas han sido transfectadas, en el laboratorio, con un virus (lentivirus) portador de la copia correcta del gen FANCA, restaurando también la función de este gen. Estas dos estrategias de terapia génica se denominan EX VIVO porque las células a corregir se extraen del paciente afectado, y, ya en el laboratorio pueden corregirse (añadiendo el lentivirus, o editándolas con el sistema CRISPR-Cas9), seleccionar las corregidas y retornarlas al paciente. La otra ruta que se plantea en terapia génica, más comprometida y difícil de acometer, se denomina IN VIVO. En este caso se administran directamente los virus o las herramientas de edición genética en el cuerpo del paciente. Naturalmente, la estrategia IN VIVO es mucho más arriesgada que la ruta EX VIVO. Pero para tejidos en los que no es posible obtener células troncales para poder regenerarlos, como es el caso de la sangre, es la única disponible.

El trabajo del equipo de Paula Río demuestra que también es posible encontrar una oportunidad terapéutica en el azar.

 



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